Las proteínas son macromoléculas formadas por aminoácidos. Se han descrito unos 500 aminoácidos distintos en la naturaleza, pero curiosamente, solo 20 son los esenciales presentes en el cuerpo humano. El ADN contiene toda la información necesaria para que una proteína pueda ser sintetizada, ya que mediante mecanismos de transcripción y traducción, un triplete de nucleótidos de ADN se convierte en un aminoácido concreto.
Los ribosomas son los orgánulos encargados de ensamblar estos aminoácidos, dando lugar a cadenas con órdenes y longitud variable, o lo que es lo mismo, lo que nosotros conocemos como proteínas. Estas biomoléculas son esenciales para concebir la vida, pues suponen aproximadamente el 80% del protoplasma en seco en toda célula y representan el 50% del peso en todos los tejidos vivos.
Con estos datos en la mano, nos queda más que claro la importancia de las proteínas en la generación de vida. Hoy venimos a traerte un mecanismo muy interesante relacionado con esta temática, pues te lo contamos todo sobre el método de Bradford, ideado para cuantificar la concentración proteica de una solución.
- Artículo relacionado: "¿Qué es el método científico y cómo funciona?"
¿En qué consiste el método de Bradford?
El método de Bradford (conocido como Bradfords protein essay en inglés) fue descrito, como su propio nombre indica, por el científico americano Marion Mckinley Bradford, en el año 1976. En primer lugar, es necesario destacar que se trata de un método espectrométrico, término que engloba a un conjunto de procedimientos laboratoriales basados en la interacción de la radiación electromagnética con un analito (el componente de interés que se quiere separar de la matriz).
Además de esto, cabe señalar que se trata de un método de naturaleza colorimétrica, es decir, que obtiene resultados en base a los colores y su concentración en una solución concreta. La clave de este conglomerado terminológico se encuentra en el colorante “azul de Coomassie”, ya que en el método de Bradford se cuantifican los cambios en su absorbancia según ciertos parámetros. Este colorante se muestra azul en su forma aniónica, verde en la neutral y rojo en la catiónica.
En condiciones ácidas en la solución, el azul de Coomassie se torna de rojo a azul y, en el proceso, se une a las proteínas que se quieren cuantificar. Si no hay proteínas en el medio acuoso, la mezcla permanece de un color marrón, así que es muy fácil detectar la presencia de estas macromoléculas en primera instancia con esta metodología.
Las bases químicas del método de Bradford
Entramos en terrenos un poco más complejo, pues es hora de describir qué es lo que sucede entre estas moléculas más allá de los cambios de color directos. Al unirse con la proteína, el azul de Coomassie en su forma catiónica y doble protonada (roja) forma una unión no covalente muy fuerte con dicha macromolécula, mediante fuerzas de van der waals e interacciones electrostáticas.
Durante la formación de este complejo químico, el colorante le dona a las porciones ionizables de la proteína su electrón libre (recordamos que catión=carga positiva, pierde electrones), lo que causa la disrupción del estado proteico normal. Esto expone ciertas sustancias que podrán generar las uniones previamente descritas, en las cuales no nos vamos a detener por su complejidad química. En resumen, solo hace falta saber lo siguiente:
Colorante rojo (catiónico/no unido a la proteína) ≠ Colorante azul (aniónico/unido a la proteína)
Con base en esta premisa, cabe destacar que el colorante rojo presenta un espectro de absorción de 465 nm, valor que representa la radiación electromagnética incidente que un material absorbe dentro de un rango de frecuencias. En la forma azul aniónica (interaccionando con proteínas), se produce un cambio en la absorción a 595 nm. Por ello, en una solución sometida al método de Bradford, se realizan lecturas en espectrofotómetros a un rango de 595 nm.
El aumento de absorbancia en este espectro es directamente proporcional al número de uniones entre el colorante y las proteínas, así que no solo se detecta que existen proteínas con el cambio de color, sino también se puede estimar cuánta proteína hay por mililitro de medio líquido. Increíble, ¿verdad?
- Quizás te interese: "Material de laboratorio: 23 objetos e instrumentos imprescindibles"
Procedimiento del método de Bradford
Para poder realizar esta metodología es necesario un espectrofotómetro, que no es precisamente barato (unos 2.000 euros aproximadamente), así que no es algo que se pueda ejecutar desde casa. Esta máquina es capaz de proyectar un haz de luz monocromático a través de una muestra, con la finalidad de medir la cantidad de luz que es absorbida por los compuestos de interés. Así, el investigador recibe información sobre la naturaleza de las moléculas en la solución en cuestión y, de paso, también es capaz de calcular la concentración de dicha molécula.
Además, es necesario destacar que el reactivo no se trata únicamente de azul de Coomassie “en bruto”. Se deben disolver 100 miligramos del colorante en 50 mililitros de una solución de etanol al 95% y añadir 100 mililitros de ácido fosfórico al 85%. Además, es necesario diluirlo a un litro una vez el colorante se ha disuelto y filtrar la mezcla, para dar lugar al reagente definitivo que se utiliza en el método. El color de esta solución sin proteínas presentes, como hemos dicho, debe ser marronáceo.
Una vez el investigador cuenta con el reagente y el espectrofotómetro, debe seguir los siguientes pasos:
- Preparar el espectrofotómetro y comprobar su correcto funcionamiento.
- Preparar la solución proteica que se va a analizar. Lo ideal es que dicha muestra contenga entre 5 y 100 microgramos de proteína por cada 100 microlitros de solución total. Es obvio que no se sabe la concentración exacta, pero son los valores máximos y mínimos.
- Preparar estándares. No vamos a entrar en sus particularidades por la complicación química que conllevan.
- Añadir a la solución 5 mililitros de reagente y dejarla incubar por 5 minutos.
- Medir la absorbancia de la mezcla en el espectrofotómetro a 595 nm.
Los resultados aparecerán en la pantalla del espectrofotómetro, y deben ser apuntados por el profesional que esté llevando la investigación. Una vez se tengan, es necesario crear una gráfica (curva de calibración) que enfrente dos valores en sus ejes: absorbancia vs microgramos de proteína. A partir de la curva generada con los valores, estos se pueden extrapolar para obtener la concentración exacta de proteína en la solución.
Ventajas
El método de Bradford es muy fácil de ejecutar para cualquier persona relacionada con el ámbito laboratorial, pues todo biólogo y químico se ha enfrentado durante sus años de estudio a un espectrofotómetro al menos una vez. Ya sea para medir la cantidad de clorofila en una solución a partir del machacado de una hoja (lo típico) hasta cosas mucho más complejas, los espectrofotómetros están muy extendidos en los ámbitos de aprendizaje.
Además de su facilidad, cabe destacar que muchas proteínas en su estado natural presentan un rango de absorción extremadamente bajo, en 280 nm. Ni siquiera todas las proteínas llegan a este valor, pues para ello deben presentar aminoácidos específicos (tirosina, fenilalanina y triptófano), los cuales no siempre están presentes. Como esta cifra de absorbancia se encuentra en el rango UV, es necesaria una máquina especial que casi nadie tiene para poder tratarlas.
Realmente, lo que se hace en el método de Bradford es “aumentar” el valor de absorbancia de las proteínas mediante la unión a un colorante. Además de ser mucho más fáciles de leer en este estado, las proteínas se alejan de los espectros de absorbancia de otras moléculas biológicas, que podrían contaminar la muestra.
Resumen
En esta pequeña clase de química, nos hemos sumergido en uno de los métodos de cuantificación proteica más sencillos y fáciles de ejecutar, siempre que se cuente con el material pertinente. De todas formas, debemos resaltar que, como todo en esta vida,tampoco es perfecto e infalible: suele ser necesario hacer múltiples diluciones de la muestra para su análisis (valores mínimos y máximos de 0 µg/mL to 2000 µg/mL), lo que puede llevar a equivocaciones durante el proceso.
Además, la presencia de detergentes y otros compuestos en la solución pueden impedir el correcto desarrollo del método. Por suerte, existen otros reagentes que se pueden adicionar a la mezcla para solventar estos problemas en muchos casos.
Referencias bibliográficas:
- Compton, S. J., & Jones, C. G. (1985). Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay. Analytical biochemistry, 151(2), 369-374.
- Ernst, O., & Zor, T. (2010). Linearization of the Bradford protein assay. Journal of visualized experiments: JoVE, (38).
- Friedenauer, S., & Berlet, H. H. (1989). Sensitivity and variability of the Bradford protein assay in the presence of detergents. Analytical biochemistry, 178(2), 263-268.
- He, F. (2011). Bradford protein assay. Bio-protocol, e45-e45.
- Jones, C. G., Hare, J. D., & Compton, S. J. (1989). Measuring plant protein with the Bradford assay. Journal of chemical ecology, 15(3), 979-992.
- López, J., Imperial, S., Valderrama, R., & Navarro, S. (1993). An improved Bradford protein assay for collagen proteins. Clinica chimica acta, 220(1), 91-100.
- Zor, T., & Selinger, Z. (1996). Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity: theoretical and experimental studies. Analytical biochemistry, 236(2), 302-308.
